Cryo

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3961 (2023) Citer cet article

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Les phycobilisomes (PBS) sont les principaux complexes de collecte de lumière de la photosynthèse chez les cyanobactéries et les algues rouges. CpcL-PBS est un type de petit PBS chez les cyanobactéries qui transfère l'énergie directement au photosystème I sans la structure centrale. Nous rapportons ici la structure cryo-EM du CpcL-PBS de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC 6803 à une résolution de 2,6 Å. La structure montre le domaine CpcD de la ferrédoxine : la NADP+ oxydoréductase est située à l'extrémité distale du CpcL-PBS, responsable de son attachement au PBS. Grâce aux preuves d'absorption transitoire ultrarapide et de spectroscopie de fluorescence, les rôles des bilines individuelles dans le transfert d'énergie sont révélés. La biline 1Iβ822 située près du photosystème I a une planéité améliorée et est la biline rouge responsable du transfert direct d'énergie vers le photosystème I.

Les cyanobactéries sont l'un des premiers groupes d'organismes à convertir l'énergie solaire en énergie chimique1,2. Ce sont les premiers organismes à avoir créé un transfert linéaire d'électrons avec deux photosystèmes, le photosystème II (PSII) et le photosystème I (PSI), et ont été responsables de l'augmentation de la teneur en oxygène sur Terre il y a plus de 2,4 milliards d'années1,2,3. Les principales antennes de collecte de lumière pour capter l'énergie solaire chez les cyanobactéries et les algues rouges sont les phycobilisomes (PBS)4,5,6,7, qui transfèrent l'énergie lumineuse absorbée vers le PSII ou le PSI pour piloter le transfert d'électrons. Le PBS est constitué de phycobiliprotéines (PBP), auxquelles sont attachés de manière covalente des pigments appelés bilines, et de protéines de liaison4,8. Deux types de PBS existent chez les cyanobactéries, le CpcG-PBS et le CpcL-PBS. CpcG-PBS se compose de deux parties : un noyau et des bâtonnets périphériques, qui sont associés au noyau via les protéines de liaison CpcG. Les structures cryo-EM PBS récemment déterminées à partir d'algues rouges9,10 et de cyanobactéries11,12,13 ont révélé comment les protéines de liaison et les PBP sont organisées en architectures de récolte de lumière hautement ordonnées. Le CpcL-PBS a une taille beaucoup plus petite et se compose d’un seul bâtonnet sans noyau d’allophycocyanine14,15,16. CpcL-PBS, qui est attaché aux membranes thylakoïdes via la protéine de liaison CpcL (également appelée CpcG2 dans Synechocystis 6803 et CpcG3 dans Anabaena 712017), est associé au PSI18 et est capable de transférer l'énergie lumineuse absorbée au PSI16,19. CpcL-PBS est également impliqué dans la formation du supercomplexe NAD(P)H-déshydrogénase (NDH)-CpcL-PBS-PSI (NDH-PBS-PSI) pour le transfert d'électrons cycliques (CEF)20 et une étude récente montre que l'attachement de ferrédoxine-NADP + oxydoréductase (FNR) au CpcL-PBS est requis pour le CEF21. La plupart des FNR cyanobactériens contiennent trois domaines : le domaine CpcD, le domaine de liaison FAD et le domaine de liaison NADPH, et le FNR à trois domaines (FNR3D) est attaché aux bâtonnets périphériques des cyanobactériens CpcG-PBS et CpcL-PBS22,23,24. Cependant, l'attachement de FNR3D aux bâtonnets de PBS n'a pas été observé dans les structures cryo-EM récemment déterminées CpcG-PBS11,12,13. Pour comprendre le mécanisme de transfert d'énergie direct du CpcL-PBS au PSI et son rôle dans la formation du supercomplexe NDH-PBS-PSI, nous déterminons les structures cryo-EM du CpcL-PBS avec un FNR attaché de Synechocystis 6803. Combiné avec la spectroscopie picoseconde Preuve, notre étude révèle la nature de la biline décalée vers le rouge, semblable à un émetteur terminal, et met en lumière la façon dont CpcL-PBS pourrait transférer efficacement l'énergie lumineuse au sein du PBS et vers le PSI en l'absence de noyau de PBS.

Les CpcL-PBS ont été préparés à partir d'une souche de Synechocystis 6803 dépourvue des gènes de apcAB24 et les CpcL-PBS purifiés ont été analysés spectroscopiquement et biochimiquement pour déterminer leur composition et leur intégrité fonctionnelle (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse SDS-PAGE suivie du séquençage N-terminal de la protéine a révélé que le CpcL-PBS purifié contenait de la phycocyanine (PC) et des protéines de liaison, notamment CpcA, CpcB, CpcC1, CpcC2 et CpcL. La préparation CpcL-PBS contient également le FNR à trois domaines avec une masse moléculaire de 45 kDa (Fig. 1e supplémentaire). Le spectre d'absorption du CpcL-PBS isolé présente une absorption maximale à 620 nm (Fig. 1g supplémentaire), typique d'une absorption de phycocyanine. Son spectre d'émission de fluorescence à température ambiante présente deux pics, l'un à 648 nm et l'autre à 668 nm, comme indiqué précédemment24,25. Le pic d'émission à 648 nm est similaire à celui de l'hexamère de phycocyanine avec un lieur CpcG , tandis que le pic d'émission à 668 nm de la phycocyanine (PC) n'a pas été observé dans d'autres trimères ou bâtonnets de PC (Fig. 1g supplémentaire). À 77 K, un pic d'émission majeur à 670 nm est observé (Fig. 1h supplémentaire). L'analyse par microscopie électronique (EM) à coloration négative de l'échantillon CpcL-PBS montre qu'il contient des structures en forme de bâtonnets et que la majorité des bâtonnets contiennent trois hexamères. Certaines particules contenant plus de trois hexamères αβ ont également été trouvées (Fig. 1f supplémentaire), indiquant que les complexes CpcL-PBS sont de nature hétérogène, ce qui est cohérent avec un travail antérieur . Pour minimiser le démontage du complexe PBS lors de la préparation de la cryo-grille, les échantillons ont été traités avec 0,012% de glutaraldéhyde et les particules de CpcL-PBS ont été automatiquement sélectionnées et classées (Fig. 2 supplémentaire). Une carte de densité de 2, 6 Å de CpcL-PBS contenant trois couches d'hexamères a été obtenue, ce qui nous a permis de construire des modèles atomiques pour tous les chromophores (bilines) et chaînes protéiques (Fig. 3a à d supplémentaire). Notamment, l’architecture à trois couches était l’espèce dominante, les classifications 2D et 3D n’ayant pas réussi à enrichir les autres populations. Ce complexe CpcL-PBS à trois couches mesure 160 Å de longueur et 100 Å de diamètre (Fig. 1a – c). Le complexe contient 40 sous-unités, dont 18 monomères PC αβ (hétérodimère CpcA-CpcB) et trois protéines de liaison, CpcL, CpcC1 et CpcC2 dans une stœchiométrie 1: 1: 1 (Fig. 1d, e). Le domaine CpcD du FNR3D a pu être clairement identifié à l'extrémité distale du CpcL-PBS (Fig. 1d, e). Les quatre lieurs sont organisés dans un ordre CpcL-CpcC1-CpcC2-CpcD (de FNR3D) de manière presque linéaire avec CpcL proche de la membrane thylakoïde et FNR3D à l'extrémité distale (Fig. 1d, e). CpcL-PBS ressemble beaucoup au bâtonnet de CpcG-PBS de Synechocystis 680313 avec un RMSD de 0, 4 Å entre eux (Fig. 1f). Ces lieurs forment un squelette de lieur qui fournit un support pour l'assemblage CpcL-PBS et son association avec le PSI (Fig. 1g).